問題解析：熒光定量PCR反應結束無擴增曲線

　　熒光定量 PCR反應結束無擴增曲線出現這個問題的常見原因，主要可以歸結為以下幾種：

　　反應循環數不夠：一般建議設置循環數為 40。

　　程序中未設置信號采集步驟：注意，兩步法擴增程序一般將信號采集設置在退火延伸階段;三步法擴增程序應當將信號采集設置在 72 度延伸階段。

　　引物降解：長時間未使用的引物應先通過 PAGE 電泳檢測完整性，以排除引物降解的可能性。

　　模板濃度太低：這個大家減少稀釋度重復實驗就可以了，一般來說，未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

　　模板降解：無解，請重新制備模板，可以重復實驗。

　　溶解曲線形狀異常

　　(1)雜峰在主峰之前，Tm 約為 70 - 75℃——一般為引物二聚體

　　這種情況主要有三個解決方法：

　　重新設計引物;

　　雜峰為引物二聚體，熒光定量 PCR引物二聚體主要是由于體系內引物與引物糾纏比引物與模板結合更容易導致的，可以嘗試提高模板濃度、退火溫度或者降低引物濃度來進行改善;

　　另外，當目的基因表達量極低時，染料法容易形成引物二聚體產物影響實驗結果，此時，建議使用探針法定量。

　　(2)雜峰在主峰之后，非引物二聚體

　　上圖這種情況就是非特異性擴增，可能是引物特異性不好引起的，也可能是空氣中有氣溶膠污染所導致。

　　大家可以先增加退火溫度再試試看，如果沒有改善，那么就需要重新更換引物啦。

　　為了避免這種麻煩，BUNSEN本生小編建議大家在進行熒光定量 PCR實驗之前，就對自己的引物做一個特異性驗證。另外，每次試驗的 NTC(no template control)是一定要做的。

　　(3)只有引物二聚體，無目的條帶

　　如果擴增片段過短(小于 80bp)，那么僅通過融解曲線就很難區分引物二聚/目的條帶。

　　另外，也有可能是 熒光定量 PCR 擴增效率低或者沒有擴增，體系里邊只有引物糾纏成的二聚體了。

　　總之，產物長度建議大家還是設置在 100 - 200 bp，不要太短了。

　　注：以上資料僅供參考!

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